日益嚴(yán)重的草甘膦耐藥性

草甘膦自20世紀(jì)70年代問世以來,風(fēng)靡全球,逐漸成為最廉價(jià)、應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的廣譜除草劑。它通過特異性來抑制植物生長(zhǎng)代謝過程中關(guān)鍵的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶,從而引起包括雜草在內(nèi)的植物代謝紊亂和死亡?！耙虼?培育抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物并搭配草甘膦在田間使用,是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中控制雜草的一種重要方式?！惫鹜ソ榻B。

然而,隨著草甘膦的廣為使用及濫用,數(shù)十種雜草逐漸進(jìn)化,產(chǎn)生了較高的草甘膦耐受性。此外,抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因作物并不能夠分解草甘膦,導(dǎo)致草甘膦會(huì)在作物內(nèi)積累和轉(zhuǎn)運(yùn),還有可能通過食物鏈傳播危害人類健康。

因此,亟須挖掘可以降解草甘膦的基因,以培育低草甘膦殘留的高抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物。

2019年,中國(guó)和澳大利亞的研究團(tuán)隊(duì)首次從抗草甘膦的芒稗中,鑒定出2個(gè)降解草甘膦的醛酮還原酶--AKR4C16和AKR4C17,AKR4C16和AKR4C17利用NADP+(煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸,一種輔酶)作為輔因子,將草甘膦降解為無毒的氨甲基膦酸和乙醛酸。

“AKR4C16和AKR4C17是首次報(bào)道的植物自然進(jìn)化產(chǎn)生的草甘膦降解酶?！北疚墓餐ㄓ嵶髡叽髀『８苯淌谡f,但對(duì)于這兩個(gè)蛋白是怎么催化草甘膦降解的分子機(jī)制一直尚不清楚,阻礙了進(jìn)一步開發(fā)利用這兩種降解酶解決耐藥性和草甘膦難以降解的難題。

酶結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)改造提升草甘膦降解效率

為了深入探究AKR4C16和AKR4C17降解草甘膦的分子機(jī)制,郭瑞庭教授團(tuán)隊(duì)通過X射線晶體衍射技術(shù)分別解析了這兩種酶與輔因子高分辨率的復(fù)合體結(jié)構(gòu),揭示了草甘膦、NADP+與AKR4C17合成三元復(fù)合體的結(jié)合模式,提出了AKR4C16和AKR4C17介導(dǎo)草甘膦降解的催化反應(yīng)機(jī)制。

NADP+和草甘膦分別與AKR4C17活性區(qū)關(guān)鍵氨基酸殘基通過氫鍵、疏水作用等分子間作用力,結(jié)合在AKR4C17的底物結(jié)合區(qū)。然后,NADP+的煙酰胺基團(tuán)的C4位點(diǎn)奪取草甘膦C2位的一個(gè)氫原子；C2位失去1個(gè)氫原子的草甘膦分子不穩(wěn)定,在活性區(qū)的催化氨基酸位點(diǎn)經(jīng)由草甘膦的磷酸基團(tuán)輔助下,草甘膦分子內(nèi)的C-N鍵氧化斷鏈,降解為無毒的氨甲基膦酸和乙醛酸,這一過程中NADP+同時(shí)被還原生成NADPH。

在獲得了AKR4C17/NADP+/草甘膦的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)模型后,郭瑞庭教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)草甘膦與AKR4C17的底物結(jié)合區(qū)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)草甘膦分子的磷酸基團(tuán)與AKR4C17底物口袋缺少有效的分子間相互作用力,使得草甘膦與AKR4C17底物口袋的結(jié)合不夠牢固,可能不利于AKR4C17催化草甘膦的降解反應(yīng)。

通過對(duì)AKR4C17的結(jié)構(gòu)分析,團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)AKR4C17底物口袋區(qū)的苯丙氨酸F291位點(diǎn)與草甘膦的磷酸基團(tuán)距離較近,將F291位點(diǎn)突變成組氨酸(F291H)、賴氨酸(F291K)、精氨酸(F291R)或天冬氨酸(F291D)后,研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)這些突變體的活性均有不同程度的提升；其中,F291D突變體對(duì)草甘膦的催化活性較野生型AKR4C17提高了70%。進(jìn)一步解析AKR4C17F291D的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),F291D位點(diǎn)的突變?cè)鰪?qiáng)了AKR4C17底物結(jié)合口袋與草甘膦分子間的親水作用,從而使草甘膦分子更穩(wěn)定地結(jié)合在AKR4C17的底物結(jié)合口袋,增強(qiáng)了AKR4C17介導(dǎo)的草甘膦降解反應(yīng)。

“我們的工作揭示了AKR4C16和AKR4C17催化草甘膦降解的分子機(jī)制,為進(jìn)一步改造AKR4C16和AKR4C17,以提高其對(duì)草甘膦的降解效率奠定了重要的基礎(chǔ)；另外,我們成功構(gòu)建了草甘膦降解效率提升的突變體蛋白AKR4C17F291D,為培育低草甘膦殘留的高抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物,以及利用微生物工程菌降解環(huán)境中的草甘膦,提供了重要的參考?！贝髀『１硎?。