本文通過(guò)incoPat科技創(chuàng)新情報(bào)平臺(tái)(IncoPat收錄了全球102個(gè)國(guó)家/組織/地區(qū)1億余件專利信息) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用關(guān)鍵詞及分類號(hào)(蝗蟲、螞蚱、locust、locusts、grasshopper、A01N63、C12N、C12R、A01P7/06、A01P7/04、A01P7/02、A01P7/00)對(duì)2000年01月01日至2020年10月15日之間的專利數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索統(tǒng)計(jì)。通過(guò)全面分析生物方法防治蝗蟲的中國(guó)專利申請(qǐng)態(tài)勢(shì)、重點(diǎn)申請(qǐng)人狀況和專利技術(shù)分析,為生物防治蝗蟲提供專利信息支撐。

1  中國(guó)專利申請(qǐng)態(tài)勢(shì)

圖1給出了生物防治蝗蟲的申請(qǐng)趨勢(shì)?？梢钥闯?生物防治蝗蟲的專利數(shù)量并不是很多,發(fā)展也比較晚。2013年以前每年申請(qǐng)的專利數(shù)量少于10件,2013年以后申請(qǐng)的數(shù)量逐漸增加,但是到2019年每年的申請(qǐng)數(shù)量也未能突破30件。申請(qǐng)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)范圍是目前已公開(kāi)的專利。由于時(shí)間原因,部分新申請(qǐng)的專利可能還處于未公開(kāi)的狀況,導(dǎo)致(圖1)2020年的申請(qǐng)量出現(xiàn)偏低的情況。

圖1  生物防治蝗蟲專利申請(qǐng)趨勢(shì)

2  主要申請(qǐng)人的申請(qǐng)量趨勢(shì)

由圖2可以看出,國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人主要以高校和研究所為主,其中山西大學(xué)是生物防治蝗蟲領(lǐng)域申請(qǐng)量最多的申請(qǐng)人,從2000年至今年累計(jì)申請(qǐng)量達(dá)到42件。排名第二的是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,申請(qǐng)量達(dá)25件,明顯高于其余申請(qǐng)人。

圖 2  主要申請(qǐng)人的申請(qǐng)量排名

3  國(guó)內(nèi)主要申請(qǐng)人的重點(diǎn)研究方向

3.1  山西大學(xué)

由圖3可以看出,山西大學(xué)在蝗蟲生物防治研究方面主要著力與RNAi干擾技術(shù)的研究。RNA干擾( RNAi)是一種通常由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象,這一發(fā)現(xiàn)不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破,同時(shí)也為人類的疾病治療和作物害蟲防治開(kāi)辟了新的途徑。山西大學(xué)主要研究了通過(guò)不同的基因干擾昆蟲幾丁質(zhì)、昆蟲表皮酯質(zhì)合成、表皮蛋白等影響抑制蝗蟲蛻皮,達(dá)到殺死蝗蟲的效果。

圖3  山西大學(xué)防治蝗蟲研究方向

3.2  中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所

圖4顯示中國(guó)農(nóng)科院植保保護(hù)研究所在RNAi干擾、真菌防治、通過(guò)基因引起免疫抑制反應(yīng)調(diào)節(jié)真菌對(duì)蝗蟲侵染的效果等方面都進(jìn)行了一定的研究。RNAi干擾技術(shù)著力研究相關(guān)基因干擾蝗蟲的生長(zhǎng)發(fā)育,通過(guò)干擾蝗蟲的發(fā)育達(dá)到防治蝗蟲的目的。真菌防治方面,中國(guó)農(nóng)科院植保研究所主要研究了相關(guān)蛋白基因增強(qiáng)綠僵菌殺滅蝗蟲的效率,綠僵菌及金龜子綠僵菌與相關(guān)化藥的組合物。中國(guó)農(nóng)科院植保所還通過(guò)相關(guān)基因?qū)е禄认x產(chǎn)生免疫的應(yīng)答達(dá)到致死蝗蟲的效果。

圖4  中國(guó)農(nóng)科院植保所蝗蟲研究方向

3.3  四川大學(xué)

申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)一種殺蟲蛋白,該蛋白分子量為25,100 Da。經(jīng)研究表明,該菌無(wú)芽孢,本身具有較強(qiáng)毒蛋白,具有構(gòu)建成為遺傳工程菌廣泛用于生物防治的潛力。由圖5可知,四川大學(xué)在抗殺蟲基因技術(shù)上做了相關(guān)研究。此外,申請(qǐng)人還對(duì)真菌及植物來(lái)源的活性化合物對(duì)蝗蟲的防治進(jìn)行了相關(guān)研究。

圖5  四川大學(xué)蝗蟲防治研究方向

3.4  重慶大學(xué)

由圖6可以看出,重慶大學(xué)在RNAi干擾技術(shù)和真菌防治蝗蟲方面進(jìn)行了研究。重慶大學(xué)研究了ATP合酶α和β亞基基因cDNA 的保守序列,并構(gòu)建其RNA、DNA等構(gòu)建體,利用RNAi技術(shù)沉默蝗蟲體內(nèi)ATP合酶α亞基,使體內(nèi)ATP合酶α亞基的表達(dá)明顯受到抑制,導(dǎo)致蝗蟲產(chǎn)生致死效應(yīng),可應(yīng)用于RNAi技術(shù)對(duì)東亞飛蝗害蟲防治。重慶大學(xué)還研究了蝗綠僵菌工程菌株的制備,綠僵菌,以及綠僵菌和化學(xué)農(nóng)藥的組合物進(jìn)行蝗蟲防治。

圖6  重慶大學(xué)蝗蟲防治研究方向

3.5  中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)

蝗蟲微孢子蟲是一種蝗蟲專性的寄生原生動(dòng)物,只對(duì)蝗蟲等直翅目昆蟲有致病性,對(duì)脊椎動(dòng)物完全無(wú)致病性,在田間使用過(guò)程受環(huán)境條件的限制較小、生產(chǎn)成低,在防治蝗蟲災(zāi)害的方面有很強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)力。由圖 7可以看到中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)主要研究方向是蝗蟲微孢子在防治蝗蟲方面的應(yīng)用。

圖7  中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)蝗蟲防治研究方向

4  生物防治蝗蟲專利技術(shù)分析

通過(guò)國(guó)內(nèi)主要申請(qǐng)人生物防治蝗蟲的研究方向分析可以看出,我國(guó)在蝗蟲生物防治方面主要研究方向集中在以下3個(gè)方面：(1)RNA干擾技術(shù)；(2)真菌防治；(3)蝗蟲微孢子。

4.1  RNA干擾技術(shù)

RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象,自2006年獲得諾貝爾獎(jiǎng)以來(lái),RNAi技術(shù)一直躋身于科技前沿。RNAi不僅是研究基因功能的有力工具,同時(shí)在害蟲防治方面也具有極大潛力。通過(guò)RNA干擾進(jìn)行害蟲防治具有如下特點(diǎn)：1)殺蟲具有專一性,對(duì)非靶標(biāo)生物無(wú)殺傷作用；2)RNA在自然界極易降解,無(wú)殘留；3)對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害,相對(duì)安全。因此學(xué)者將其稱為第四代殺蟲劑?；赗NA干擾進(jìn)行害蟲防治的基礎(chǔ)技術(shù)是篩選靶標(biāo)序列獲得具有高致死作用的dsRNA。廣泛用于昆蟲RNAi實(shí)驗(yàn)的基本方法有兩種。一種方法是采用體外合成的dsRNA,然后將其導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)或細(xì)胞中,稱為外源性RNAi；另一種方法是用DNA表達(dá)載體導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)或細(xì)胞中,在體內(nèi)或細(xì)胞中表達(dá)時(shí)合成dsRNA,稱為內(nèi)源性RNAi。盡管內(nèi)源性方法可以在昆蟲生活史的任何時(shí)間實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性或組織特異性的RNAi,具有遺傳性等優(yōu)點(diǎn),但由于很多昆蟲還沒(méi)有建立成功的轉(zhuǎn)基因體系,所以這種方法目前還并不適合許多昆蟲的基因功能研究。因此外源性RNAi是目前研究的重點(diǎn)手段。國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人研究的方向也主要是通過(guò)篩選基因序列合成相關(guān)的dsRNA,然后將其導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)或細(xì)胞中進(jìn)行防治蝗蟲研究。

4.2  真菌防治

昆蟲病原真菌是昆蟲病原生物中的最大類群。據(jù)野外調(diào)查越冬昆蟲發(fā)現(xiàn),昆蟲疾病中約有60%是由真菌引起的,病原真菌也是最早被系統(tǒng)地利用來(lái)控制害蟲的昆蟲病原微生物。

蝗蟲的主要病原真菌,包括綠僵菌 M. anisopliae、白僵菌 B. bassiana、黃綠僵菌 M. flavoviride、黃曲霉菌 Aspergillus flavus 等。我國(guó)申請(qǐng)人中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、重慶大學(xué)、四川大學(xué)、中科院動(dòng)物研究所、江西天人生態(tài)股份有限公司等都對(duì)綠僵菌、白僵菌進(jìn)行了相關(guān)研究,也有對(duì)蛋白或化學(xué)農(nóng)藥與綠僵菌或白僵菌組合來(lái)提高相應(yīng)真菌的殺蟲效果的研究。

白僵菌是一種半知菌類的蟲生真菌,可以侵入6個(gè)目15科200多種昆蟲、螨類的蟲體內(nèi)大量繁殖,同時(shí)不斷產(chǎn)生白僵素(大環(huán)脂類毒素)和草酸鈣結(jié)晶,這些物質(zhì)可引起昆蟲中毒,使體液發(fā)現(xiàn)機(jī)能發(fā)生變化,打亂新陳代謝以致死亡。金龜子綠僵菌屬于半知菌亞門綠僵菌屬,是一種廣譜的昆蟲病原真菌,可寄生于多種昆蟲體內(nèi)。綠僵菌具有顯著的殺蟲效果,并且具有不同于現(xiàn)有殺蟲劑的全新的作用機(jī)理,主要作用于昆蟲血淋巴免疫系統(tǒng),使之喪失免疫防御功能。白僵菌和綠僵菌制劑對(duì)人、畜無(wú)毒,對(duì)作物安全,無(wú)殘留、無(wú)污染,但能感染家蠶幼蟲,形成僵蠶病。因此,白僵菌和綠僵菌制劑防治蝗蟲具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

4.3  蝗蟲微孢子

蝗蟲微孢子 Nosema(Paranosema)locustae是一種可以侵染100多種直翅目昆蟲的單細(xì)胞真核病原微生物,其在田間的應(yīng)用范圍非常廣泛?；认x取食了被蝗蟲微孢子污染過(guò)的食物后,孢子即在蝗蟲消化道中萌發(fā),暴發(fā)性地突出極絲尖端,穿進(jìn)寄主細(xì)胞和中腸腸壁細(xì)胞,到達(dá)血腔,進(jìn)入感受性組織細(xì)胞如在脂肪體中開(kāi)始無(wú)性裂殖生殖,將孢子的孢原質(zhì)釋放出來(lái),開(kāi)始在寄主的細(xì)胞內(nèi)大量繁殖,消耗蝗蟲體內(nèi)的能源物質(zhì),導(dǎo)致蟲體總脂含量和血淋巴甘油脂含量大幅度下降及血淋巴脂肪酶活力大幅度上升,使蝗蟲出現(xiàn)畸形,發(fā)育期延長(zhǎng),壽命縮短,喪失生殖能力。此外,微孢子還可侵染蝗蟲的唾腺、圍心細(xì)胞及神經(jīng)組織；在其病蟲體內(nèi)的卵細(xì)胞、側(cè)輸卵管、中輸卵管中均發(fā)現(xiàn)有微孢子,產(chǎn)卵量下降約50%,孵化率極低,取食量下降,隨著微孢子在寄主體內(nèi)不斷增殖,使寄主的生理機(jī)能等遭到破壞而死亡?；认x微孢子不污染環(huán)境、不殺傷天敵、對(duì)人畜安全,不產(chǎn)生對(duì)其他生物的二次毒害,有利于保護(hù)生物多樣性。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)針對(duì)蝗蟲微孢子蟲的致病力一般較弱的缺陷,從田間患病的東亞飛蝗中分離篩選得到蝗蟲微孢子蟲(Antonospora locustae),命名為AL2008L-04株系,結(jié)果表明,AL2008-01株系具有良好的致病力,提高蝗蟲微孢子蟲的毒力。

5  結(jié)語(yǔ)

通過(guò)專利數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和技術(shù)分析可以看出,我國(guó)生物防治蝗蟲的研發(fā)主體集中在高校和研究所,研究的重點(diǎn)在使用RNA干擾技術(shù)。RNA干擾技術(shù)具有殺蟲具有專一性,對(duì)非靶標(biāo)生物無(wú)殺傷作用；RNA在自然界極易降解,無(wú)殘留；對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害,相對(duì)安全等優(yōu)點(diǎn)。其研究的機(jī)理是通過(guò)選擇合適的基因序列然后在體外合成的dsRNA,將合成的dsRNA 在注入蝗蟲體內(nèi)。這樣的方法在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域大規(guī)模防治蝗蟲上存在施用困難的缺點(diǎn)。因此,研發(fā)適用大規(guī)模防治蝗蟲的RNA干擾技術(shù)是未來(lái)發(fā)展的方向。

昆蟲病原真菌,相較于化學(xué)殺蟲劑,具有環(huán)境友好、抗逆性強(qiáng)、能大量擴(kuò)散、選擇性高等優(yōu)點(diǎn),是廣泛應(yīng)用的一類生物農(nóng)藥。然而,目前昆蟲病原真菌作為殺蟲劑仍然存在著致死時(shí)間較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。通過(guò)研究真菌致病機(jī)理,利用基因工程手段改造真菌,提高真菌殺蟲劑的效果是當(dāng)前研究的一個(gè)重要方向。

蝗蟲微孢子蟲是一種蝗蟲專性的寄生原生動(dòng)物,只對(duì)蝗蟲等直翅目昆蟲有致病性,對(duì)脊椎動(dòng)物完全無(wú)致病性,實(shí)驗(yàn)研究證明對(duì)蜜蜂也不感染,安全性好,而且該病原物在田間使用過(guò)程受環(huán)境條件的限制較小、生產(chǎn)成低,因此在防治蝗蟲災(zāi)害的方面有很強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)力。克服當(dāng)前蝗蟲微孢子蟲的致病力一般較弱的缺陷,篩選合適的蝗蟲微孢子蟲提高蝗蟲微孢子蟲的毒力是該領(lǐng)域值得關(guān)注的研發(fā)方向。